Sekvenciranje je proces koji uključuje određivanje nukleotidne sekvence određenog fragmenta DNA. Tijekom sekvenciranja, fragment DNA je terminalno označen nukleotidima označenim fluorescencijom pomoću PCR-a. Ovaj proces koristi četiri vrste nukleotida označenih fluorescencijom, a to su dideoksinukleotidi (ddNTP). ddNTP nedostaje 3 ′ OH skupina na koju je vezana fosfatna skupina dolaznog nukleotida. Stoga, kada se ddNTP doda rastućem lancu, neće biti daljnjeg dodavanja nukleotida na 3 ′ kraju lanca. To znači da dodavanje ddNTP -a u rastući lanac prekida rast lanca. Budući da se ddNTP -i dodaju u PCR smjesu u niskim koncentracijama, svaki rastući lanac se prekida na različitim razinama. Emitirajuća fluorescencija se detektira kako bi se odredila nukleotidna sekvenca fragmenta DNA na kraju PCR -a.

Pokrivena ključna područja

1. Što je DNK sekvencioniranje - Definicija, vrste 2. Kako djeluje DNK sekvenciranje? - Proces sekvenciranja DNK

Ključni pojmovi: dideoksinukleotidi (ddNTP), fluorescentni marker, elektroforeza u gelu, sekvenciranje sljedeće generacije, sekvenca nukleotida, PCR, sekvenciranje Sangera

Što je DNK sekvencioniranje

DNK sekvenciranje laboratorijska je tehnika koja se koristi za određivanje nukleotidne sekvence određene molekule DNA. Koristi nukleotide označene fluorescencijom, koji se ugrađuju tijekom PCR-a. Postoje dvije glavne metode sekvenciranja koje se temelje na tehnikama koje se koriste u detekciji fluorescencije: Sanger sekvenciranje i sekvenciranje sljedeće generacije.

Sanger sekvenciranje

Sangerovo sekvenciranje, koje je razvio Fredric Sanger 1975., prva je razvijena metoda sekvenciranja. Poznat je i kao metoda prekida lanca od uključen je u selektivnu ugradnju ddNTP-a koji završavaju lancem tijekom in vitro sinteze DNA. U Sangerovom sekvenciranju amplikoni se odvajaju gel elektroforezom. Sangerovo sekvenciranje široko se koristi za određivanje sekvence fragmenata DNA koji se koriste pri kloniranju i fragmenata pojačanih PCR-om. Određeni slijed DNA prikazan je na slici 1.

Slika 1: DNK sekvencioniranje

Redoslijed sljedeće generacije

Najnovije tehnologije sekvenciranja DNA kolektivno su poznate kao sekvenciranje sljedeće generacije. To je također metoda prekida lanca. Sljedeća generacija sekvenciranja koristi kapilarnu elektroforezu za odvajanje amplikona različitih duljina stvorenih metodom prekidanja lanca. Sljedeća generacija sekvenciranja koristi se za određivanje velikog broja nukleotida po nizu, kao što je sekvenciranje genoma.

Kako funkcionira sekvenciranje DNK?

Tijekom DNK sekvenciranja, nukleotidi označeni fluorescencijom dodaju se određenom fragmentu DNA pomoću PCR-a. Za produljenje lanca DNA koriste se obični deoksinukleotidi (dNTP). Međutim, u reakcijsku smjesu, koja je označena fluorescencijom, dodani su ddNTP. Budući da ddNTP nemaju 3 ′ OH skupinu u molekuli šećera deoksiriboze, možda neće doći do daljnjeg rasta lanca, čime će se prekinuti rast lanca. Šećer-fosfatna okosnica DNA nastaje stvaranjem fosfodiesterskih veza između 3 ′ OH skupine deoksiriboznog šećera i fosfatne skupine dolaznog nukleotida. Međutim, ddNTP se dodaje u niskim koncentracijama; stoga ne prekidaju rast lanca odjednom.

Četiri vrste ddNTP -a dodaju se u četiri zasebne PCR smjese. Četiri zasebne PCR reakcije provode se dodavanjem ddATP, ddGTP, ddCTP i ddTTP. Stoga se u svakoj reakcijskoj smjesi rast lanca prekida na nukleotidima A, G, C i T, respektivno. Na primjer, u reakcijskoj smjesi s dodanim ddATP -om, rast različitih amplikona je prekinut na svakom A nukleotidu u fragmentu DNA. Određivanje DNK slijeda Sangerovim sekvenciranjem prikazano je na slici 2.

Slika 2: Sanger sekvenciranje

Svaka od četiri vrste nukleotida označena je zasebnom, fluorescentnom bojom; the ddATP je označen zelenom bojom; the ddGTP je označen žutom bojom; the ddCTP je označen plavom bojom; the ddTTP je označen crvenom bojom. Stoga su amplikoni četiriju PCR reakcija označeni različitim bojama.

Nakon amplifikacije zainteresiranog fragmenta DNA, amplikoni se odvajaju ili gel elektroforezom ili kapilarnom elektroforezom. Nukleotidna sekvenca fragmenta DNA može se odrediti detekcijom emitirajuće fluorescencije. Nukleotidna sekvenca od 750-1 000 dugih fragmenata parova baza može se lako odrediti Sanger sekvenciranjem. Međutim, određivanje nukleotidne sekvence cijelog genoma ostaje izazovno zbog velikog broja nukleotida u genomima. Međutim, tehnikama sekvenciranja sljedeće generacije, poput 454 sekvenciranja, može se pročitati oko 20 milijuna parova baza po jednoj vožnji.

Zaključak

DNK sekvenciranje je tehnika molekularne biologije koja se koristi za određivanje nukleotidne sekvence fragmenata DNA. Tijekom sekvenciranja, nukleotidi označeni fluorescencijom dodaju se fragmentima DNA pomoću PCR-a. Otkrivanjem emitirajuće fluorescencije može se odrediti nukleotidna sekvenca.

Referenca:

1. "DNK sekvencioniranje". Khan Academy, dostupno ovdje.

Ljubaznošću slike:

1. "DNK sekvenca" Sjef-Vlastiti rad, javna domena) putem Commons Wikimedia 2. "Didesoxy-Methode" Christoph Goemans (modifiziert)-dr. Norman Mauder, auf Basis einer Datei von Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) putem Commons Wikimedia